Bir önceki yazımın devamı olarak mikrobiyal patojen tanısından  daha ayrıntılı  bahsetmek istiyorum. Özellikle Amerikada bugün klinik bir laboratuvarda patojen yani hastalık yapıcı bakterilerin  ayrıntılı tanısında çeşitli nükleik asit amplifikasyon (çoğaltım) yöntemleri kullanılıyor. Bunlar aşağıdaki tabloda verilmektedir.

 

Enfektif bakteri ırklarının tanısında biyokimyasal yöntemlerin yerini hızla PFGE ve  PCR’a dayalı amplifikasyonların aldığını görmekteyiz. Özellikle solunum yolları hastalıkları gibi hızlı teşhis yapılıp tedaviye başlanılması gereken hastalıkların tanısında PCR’a ek olarak DNA melezlemesi,  rRNA genlerinin amplifikasyonu yada bakteri genomlarının restriksiyon enzim kesimlerine dayalı prosedürlerin  standart hale getirilmesi FDA (Food and Drug Administartion) tarafından teşvik edilmektedir.    Ek olarak post-amplifikasyon ürünlerinin DNA dizilemesi yapılarak polimorfik genlerin saptanması da moleküler epidemiyolojiye yeni bilgiler eklemektedir.  Bu tekniklerin en önemli katkısı tanı sürelerindeki kısalma. Örneğin önemli hastalık yapıcılardan Bordetella pertussis (solunum yolu enfeksiyonu etmeni) ve Mycobacterium tuberculosis’in real-time PCR ile tanısı 1 gün gibi kısa bir süreye inmiştir. Bu test sonuçları solunum örneklerinde yapılan smear testleriyle de desteklenmektedir. Aynı şekilde Chlamydia ve Mycoplasma gibi klasik testleri uzun ve iş gücü isteyen hücre içi patojenlerde real-time PCR ‘da  teşhis edilebilmiştir. Tahmin edilebileceği gibi bu teşhislerde çeşitli gen dizileri hedef alınır. Örneğin zatüre etmeni M. pnemoniae’nın PCR için hedef genleri ATPaz operonu. C. trachomatis ve Neisseria gonorrhoeae gibi bazı bakteriyel ve fungal patojenler de ise  rRNA genleri klonlanmaktadır.  

Bakteri direncinin moleküler tanısı 

Bilindiği gibi bakteriler antibiyotiklere direnç kazanmaktadır. Bu konu mikrobiyoloji laboratuvarları açısından önem taşıyor çünkü tedavinin başarısı antibiyotik etkinliğine bağlı. Antibiyotiklere duyarlılık testi hastadan alınan örneklerin çeşitli besiyerlerinde ekimine dayanıyor. Temelde antibiyotiklere direnç bakterideki bazı özelliklerin değişimi ile gerçekleşir: (1) hücre yüzeyindeki protein pompaları (2) ilacı etkileyen hücresel enzimlerin yapısı yada  (3) ilaçla ilişkili kromozom yada plazmid bölgesindeki değişimler. Günümüzde bu konudaki çalışmaları hızlandırmak için daha çok bakterideki direnç genleri üzerinde çalışılıyor. Bunlardan biri Staphylococcus’lardaki mecA genidir. Bu gen penisiline bağlanan bir proteini  (PBP2’) şifreler. Bu protein penisiline bağlanır ancak beta-laktam türevi antibiyotiklere düşük bağlanma gösterir. Bu düşük afiniteden dolayı, PBP’’nin ortamda beta-laktamlar olsa bile metisilin antibiyotiklerine direnç sağladığı belirlenmiştir. Buna paralel olarak Staphylococ’ların metisiline dirençli ırklarının tümünde mecA geni varlığı bulunmuştur. Dolayısıyla PCR ile mecA geninin Staphylococ ırklarında varlığı veya yokluğunun test edilmesiyle dirençli ırklar ayrılabilir.  

Makrolidler önemli bir antibiyotik grubudur. Bunlar etkilerini hücredeki protein sentezini inhibe ederek gösterir. Son yıllarda özellikle solunum yolu enfeksiyonlarında kullanılan makrolid antibiyotiklerine dirençte artış gözlenmiştir. Makrolidler 23S rRNA’ya bağlanır dolayısıyla makrolid direncinde 23S rRNA’nın korunmuş bölgesinde bir mutasyon olmaktadır. Örneğin ülser etmeni Helicobacter pylori’de 23S rRNA’da nokta mutasyonları (DNA’daki tek bir bazın değişimi) olmuştur ki bunlar clarithromycin ilaçlarına direnç kazandırmışlardır. Sadece 2 nokta mutasyonunun  bu bakterideki makrolid direncini %90 oranında artırdığı PCR, RFLP ve RT-PCR ile çalışılmıştır.  

3. örnek M. tuberculosis’deki rpoB geni (RNA polimerazın beta altbirimini kodlar). Bu gendeki mutasyonlar bakterinin rifampisin antibiyotiklerine direnç kazanmasına yol açar. Bu nedenle rpoB değişimleri iyi bir moleküler markırdır ve  melezleme yada  dizileme (sequencing) teknikleriyle antibiyotik duyarlılık testlerinden daha kısa zamanlarda belirlenebilir.

Advertisements