Klinik mikrobiyolojide cins, tür ve izolat seviyesinde teşhis biyokimyasal, morfolojik ve biyolojik özellikleri test eden yöntemlere dayalıdır. Geliştirilen son biyokimyasal testler türlerin identifikasyonunu sağladığı gibi bakteri ırklarını da ayırabilir. Çok genel olarak uygulanan antimikrobiyal duyarlılık assayleri hem uygun tedaviyi belirler hem de  bakteri ırklarını tanımlamada  yardımcı olur. Ancak yüksek dirençlilik veya duyarlılık özeliği olan  patojenlerde bu tip  testlerin hassasiyeti sınırlıdır. Faj tiplemesinde olduğu gibi oldukça spesifik fenotipik belirlemeler geliştirilmesine karşın, bu testlerde kullanılan besiyeri bileşenleri her zaman ticari olarak elde edilemiyor. Biyokimyasal testler için harcanan sürenin uzun olması, sonuçların zaman zaman yanıltıcı olması ve diğer dezavantajlar fenotipe dayalı testlerin standart hale getirilmesinde engel oluşturmuştur.   

Bakteri, virüs ve mantar gibi  mikrobiyal patojenlerin  neden olduğu hastalıkların özgül, güvenilir ve hızlı teşhis edilmesi gerek bitki yetiştiriciliğinde gerekse klinik mikrobiyolojide büyük önem taşıyor. Buradaki özgüllük (specifity) tanımı ile hedef patojeni organizma üzerindeki diğer patojenlerden mutlak şekilde ayıracak bir tanı yöntemine işaret edilmektedir. Böyle bir yöntemin bakterileri  tür, patovar ve ırk düzeyinde teşhis edebilmesi ve örnekteki  en düşük  hücre sayısını belirleyebilecek şekilde etkin olması gerekli. Örneğin bitki hastalıklarına neden olan bazı patojenler bitki üzerinde epifit veya endofit olarak çok küçük  populasyonlar halinde  bulunup hastalık oluşturmazlar. Ancak  uygun ortam şartlarında bu populasyonlar artarak belli bir eşik değerine ulaşır ve hastalık ortaya çıkar. Bu tür durumlarda tanı yöntemi latent populasyonu belirleyebilmelidir. İnsanda ve bitkilerde hastalık yapan bakterilerin quorum sensing adı verilen özel bir sinyal mekanizması kullandıkları, ortamdaki sayısal artışlarını bir sinyal molekülü aracılığı ile birbirlerine iletebildikleri biliniyor. Dolayısıyla ancak hastalık için uygun şartlar oluştuğunda ortamdaki bakteri sayısı artmakta ve enfeksiyon başlamaktadır.  

Günümüzde mikrobiyal izolatları tanımlamada total-hücre protein analizleri, dış-zar profillemesi, izozim elektroforezi ve ELISA gibi çeşitli immunoblotlama teknikleri geliştirilmiştir. Genetik tiplendirmenin bu yöntemlere göre en önemli üstünlüğü  kesin ve hızlı olmasıdır. Burada identifikasyon doğrudan doğruya canlının genomu baz alınarak yapıldığından fenotipik özeliklerde gördüğümüz çevresel şartlardan (beslenme, ısı, kültür yaşı, fizyolojik durum gibi) etkilenme söz konusu olmaz. Bu çalışmalarda kullanılan moleküler genetik teknikler organizmalar arasında DNA düzeyindeki farklılıkları çeşitli derecelerde gösterebilir. Örneğin Malarya hastalığına neden olan Plasmodium spp’nin  20×106 bazlık  genomu 15 kromozom üzerinde yayılmıştır. Bu tip parazitlerde sık görülen kromozom uzunluklarındaki farklılıklar agaroz jel elektroforezine dayalı olarak saptanabilir. Erwinia ve Pseudomonas türü bitki hastalık yapıcılarında patojenite adasının yer aldığı megaplazmidler bulunur, bunlar kromozom dışı halkasal DNA molekülleridir ve  PFGE (Pulse field gel electrophoresis) adı verilen bir teknikle jel üzerinde yürütüldüklerinde farklı boyutlarda ayırım görülür. Bu çeşit bir ayırım gen düzeyinde değildir ve genel bir tanımlama yapılabilir.    

DNA’ya dayalı daha ayrıntılı tiplendirmeler  tekrarlı ve hareketli (mobile) dizilerin, ribozomal RNA genlerinin, genler arası bölgelerin yada türe özgül genlerin izini sürerek yapılabilir. Başlıca yöntemler PCR,  restriksiyon enzim kesimi veya Southern melezlemedir. Daha ileri olarak ilgili DNA bölgesinin doğrudan DNA dizi analizi yapılabilir. Klinik olarak önemli olan çok sayıda bakteri, fungus ve mikobakterilerin hızlı teşhis prosedürleri PCR (polimeraz zincir reaksiyonu) ile başarılmıştır.  1960’lı yıllarda Dubnau, 16S ribozomal RNA gen dizisinin  Bacillus spp. türlerindeki korunmuşluğuna dikkat çekmişti. Bu dizilerdeki mutasyon oranı tam olarak bilinmemekle birlikte, organizmalar arasındaki evrimsel bağları gösterdiği açıktır. 16S rRNA geni farklı taksonomik gruplarda farklı değişim geçirmiş olduğu gibi, 1550 bazlık gen boyunca dejenere olan kısımlarında  ayırt edilebilmesi mümkün olmuştur. Bu gen aynı zamanda antibiyotikler içinde önemli bir hedef olduğundan mutasyonlar bakterinin tedaviye direnç veya duyarlılığını çeşitli ölçülerde etkilemekte. 16S in dışında bakterilerde ribozomal DNA tiplendirmesinde  5S ve 23S rRNA genleri ile bunların arasındaki bölgeler kullanılıyor. Örneğin sadece 16S rRNA dizisi ile kesin ayırım yapılamayan Mycobacterium spp. gibi türlerde 16 ve 23S rRNA genleri arasındaki  ITS  (internal transcribed spacer) dizilerine bakılır.  ITS dizileri hem çeşitlilik gösteren hem de oldukça korunmuş olan elementler içermektedir. Streptococcus spp türlerinde ise 16S yerine  23S rRNA daha fazla kullanılmıştır. Bazı bakteri türlerini spesifik olarak ayırmada rRNA genlerinden daha iyi seçeneklerde vardır.  Örn. Mycobacteria’da 65kDa luk bir ısı-şoku proteinini kodlayan gen; Bartonella ve Rickettsia’da sitrat sentaz geni kullanılmıştır. Ancak taksonomik gruplandırma yapabilmek için hiçbir gen 16S rRNA kadar etkin değil. Özellikle amaç hiç bilinmeyen bir organizmayı tanımlamak ise ilk aşamada  ribozomal RNA genleri uygun bir seçim olacaktır. Diğer önemli hedef diziler, genler arasındaki palindromik dizi tekrarları. Repetitive extragenic palindromic (REP) adı verilen bu dizi tekrarları bakteri genomlarında yaygın ve korunmuştur. Örneğin E. coli kromozomunda yaklaşık 500 rep kopyası vardır. Bu dizilere özgül evrensel primerler ile yapılan çalışmalarda bir türe ait ırklar arasındaki band örnekleri incelenerek küme analizleri yapılabiliyor. Yine Pseudomonas gibi farklı bitkilerde hastalık yapıcı patovarları olan geniş gruplarda rep’e dayalı parmakizi profilleri büyük yarar sağlar. Benzer olarak klinik patojenlerde de bu ayırımlar rep-PCR ile  yapılabiliyor. Amerikada bir hastanede yapılan çalışmada  Fusarium izolatlarını  rRNA ile ayırmak mümkün olmamış, bunun yerine rep-pcr ile elde edilen farklı parmakizleri  izolatlar arasındaki farkları açıkça göstermiştir.   Bir diğer yaklaşım genomda rastgele bağlanmalar sonucu elde edilen RAPD (Random amplified polymorphic DNA) markırlarıdır. RAPD analizinde ırklar arasında farklılık gösteren markırlar seçilir ve dizi analizi yapılarak ırk teşhisinde doğrudan kullanılabilir. Bu yöntem sequence characterized amplified regions (SCAR) olarak biliniyor.  Tüm bu çalışmalar genetik düzeyde yapılan teşhislerin giderek daha fazla mikroorganizmada deneneceğini ve standart hale getirileceğini göstermektedir. Moleküler parmakizleri karşılaştırılarak  aynı zamanda yakınlık ve uzaklıkların analizi  yapılabilir ve  özellikle enfektif mikroorganizmaların belli bir lokasyondaki yayılımının incelenmesi kolaylaşabilir. 

 

pcr-sema.gif   

(Şema: Xhantomonas ırklarında REP-PCR’a dayalı olarak yakınlık ve uzaklıkları gösteren küme analizi).  

Advertisements