İçeriğe geç

Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR)

Mart 7, 2007

1967 yılında DNA parçalarını laboratuvar ortamında birbirine bağlayan DNA ligaz enzimi izole edildi. 1970’de ise ilk restriksiyon enzimi* izole edildi. Ligaz enzimleri DNA’yı bağlarken, restriksiyon enzimleri ise DNA’yı spesifik bölgelerden kesen enzimler. 1972 yılında Stanford Üniversitesinde bu enzimler kullanılarak ilk “rekombinant” DNA molekülleri elde edildi**. Bu moleküller elde edilirken, bakterilerden alınan kromozom dışı halkasal DNA molekülleri kullanılmıştı. Bugün plazmid dediğimiz bu vektörler ve geliştirilen bir çok yeni teknik genetik mühendisliği adını verdiğimiz çalışma alanının doğmasına yol açtı. Genetik mühendisliği ve genetik bilimi arasında kısa sürede yaşanan pozitif etkileşim ise sıradışı ve önemli gelişmeleri getirmiştir. 

1980’li yıllarda Kary Mullis tarafından geliştirilen Polimeraz Zincir Reaksiyonu (Polymerase chain reaction-PCR) hiç kuşkusuz ki genetik çalışmaların ivmesini artıran en önemli tekniklerden biridir. Amerikalı biyokimyacı Mullis PCR ile Kimya alanında Nobel ödülü aldı. Mullis,  California’da Cetus Corporation’da oligonükleotit (kısa DNA parçaları) sentezi üzerinde çalışırken  hücredeki DNA sentezinin laboratuvar şartlarında teknik olarak gerçekleşebileceğini tasarladı. Şöyleki: eğer bir solüsyona DNA zinciri ve  2 primer (kısa DNA parçası) katarsak, bu primerler o kalıba bağlanır ve ortamdaki bazları kullanarak  DNA’nın uzama reaksiyonunu sağlayabilirlerdi. Aynı zamanda bilgisayar programcısı olan Mullis, bu reaksiyonun tekrarlandığı takdirde teorik olarak 2n sayıda DNA kopyası oluşturabileceğini hesapladı. PCR tekrarlanan döngülerden oluşan bir klonlama reaksiyonuydu. Bu döngüler kalıp DNA’nın zincirlerinin açılması için yüksek bir sıcaklık- 95oC-, primerlerin DNA’ya bağlanması için daha düşük bir sıcaklık (50-54oC) ve sentez (72oC) aşamalarıdır. PCR’da ilk kullanılan enzim DNA polimerazın Klenow parçasıydı. Fakat ısıya duyarlı olduğundan tekrarlanan döngülerde tüplere eklenmesi gerekiyordu. Daha sonra Hoffman LaRoche şirketi tarafından lisansı alınan Thermus thermophilus bakterisinin Taq polimeraz enzimi bu sorunu çözümledi. Çünkü bu enzim uzun sıcaklık derecelerine oldukça dayanıklıydı ve tüm döngüler boyunca  verimli şekilde DNA sentezi yapabiliyordu. Günümüzde ise rekombinant DNA teknolojisiyle son derece etkili ve çeşitli enzimler üretilmektedir.  

  

pcr.gif    exponent.gif   

Temeli sıcaklık döngülerine dayanan bu DNA kopyalama tekniğinin günümüzde kullanılan çeşitlerinden bazıları:

RT-PCR (Reverse transcriptase PCR- mRNA kalıplarını kullanır),

IPCR (Inverse PCR-primer bağlanma bölgelerinin dışındaki dizilerin çoğaltımı);

RAPD-PCR (Random amplified polymorphic DNA-düşük sıcaklıkta rastgele bölgelerin çoğaltımı);

AFLP (Amplified fragment length polymorphism-kesilmiş genom DNA’sının PCRı);

CAPS (Cleaved amplified polymorphic sequence analysis – SNP’lerin PCR ve kesimlerle genom analizi);

GAWTS (Gene amplification with transcript sequencing- revers transc. kullanılarak dizileme ve transkript sentezinin PCR ile yapılması).  

Gen klonlama çalışmalarının yanısıra teşhis, tanımlama ve çeşitlilik analizlerinde kullanılan PCR’ın yeni versiyonları olarak multiplex PCR ve Real-time PCR’ı görmekteyiz. Real-time PCR kantitatif (miktarsal) bir (Q-PCR) yöntemdir ki burada her döngü sonucu elde edilen ürün miktarı floresan boyalarla “gerçek zamanlı” olarak ölçülebiliyor.

Tıp, filogenetik ve biyoteknolojinin pek çok alanında kullanılan PCR’a bir örnek adli tıptan verilebilir. Şüpheli DNA’larının tayininde kullanılan PCR’da genomda 14-100 nükleotitlik uzunluğundaki kısa dizilerin VNTR (Variable number tandem repeats) sayısı PCR ile açığa çıkarılabilir ve kişiler kesin olarak seçilebilir.  

Genom projesi sonucu hastalıklarla bağlantılı olan genlerin belirlenmesi de yine PCR ile hızlı şekilde yapılmaktadır. PGD adı verilen ve insan embriyosunda hastalık taraması yapılan prosedürde çok sayıda genetik hastalığın varlığını test etmede ve genlerdeki çeşitli  mutasyonların tayininde PCR için özel primerler tasarlanır ve dizileme analizleri ile desteklenir.    

PCR mikrobiyal dünyada da son derece etkili şekilde kullanılmaktadır. Hastalık yapıcı bakteri ve mantar türlerini ayırmada, detaylı tiplendirmede ve hızlı tanıda RAPD, REP-ERIC ve BOX PCR yöntemleri kullanılmaktadır. REP-PCR, genler arası bölgelerdeki tekrarlı korunmuş dizilerdir (Repetitive extragenic palindromic) ve bu dizilerin çoğaltımı evrensel olarak nitelendirilen primerlerle yapıldığında her bir örneğe ait çeşitli boyutlarda DNA parçaları (amplikon) üretilebilir. Bu şekilde alttürler, patovarlar ve ırklar birbirinden ayrılabilir. Ribozomal DNA genleri ise türe özgül olarak yüksek derecede korunmuştur. Bu nedenle bu genlere ve bunların ara bölgelerine (ITS-PCR- internally transcribed spacer) özgül tasarlanmış özel primerlerle  türlere/alttürlere  özel DNA kısımları üretilebiliyor.  

Karry Mullis’in orjinal makalesi Methods in Enzymology dergisinde yayınlanmıştı. O günden bugüne genetikde yaşanan süreç içinde güç kazanan bir teknoloji olarak PCR’ın bu yazıda bahsedilmeyen bir çok versiyonları bulunmaktadır.  

*, **: Bu çalışmalar için 1978’de W. Arber/D. Nathans/H. Smith, 1980’de P. Berg/W.Gilbert/F.Sanger Nobel ödülü aldılar.

 

About these ads

From → GENOTYPING

Yorum Yapın

Bir Cevap Yazın

Aşağıya bilgilerinizi girin veya oturum açmak için bir simgeye tıklayın:

WordPress.com Logo

WordPress.com hesabınızı kullanarak yorum yapıyorsunuz. Log Out / Değiştir )

Twitter picture

Twitter hesabınızı kullanarak yorum yapıyorsunuz. Log Out / Değiştir )

Facebook photo

Facebook hesabınızı kullanarak yorum yapıyorsunuz. Log Out / Değiştir )

Google+ photo

Google+ hesabınızı kullanarak yorum yapıyorsunuz. Log Out / Değiştir )

Connecting to %s

Takip Et

Her yeni yazı için posta kutunuza gönderim alın.

Diğer 35 takipçiye katılın

%d blogcu bunu beğendi: